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水中大肠菌群如何培养和鉴定

点击: 次 时间:2017-03-21 10:46

方案概述

1、菌种:污水中的大肠菌群

2、培养基:乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂EMB、营养琼脂培养基

3、仪器及器材:电炉、双目显微镜、恒温培养箱、无菌操作台、高压灭菌锅、恒温干燥箱

4根接种环、干燥器、冰箱、4个250ml锥形瓶、3支产气管、17支试管、6套培养皿、14支无菌移液管(12支1ml管、2支10ml管)

注:

1.乳糖胆盐液体培养基:由蛋白胨、乳糖、溴甲酚紫和胆盐组成,属液态、鉴别、增值、半合成培养液,实验中用于废水中菌群的培养;

2.伊红美蓝琼脂:含蛋白胨、乳糖、磷酸氢二钾、伊红-美蓝和琼脂。琼脂平板用于分离纯化肠道致病菌,特别是大肠菌群和粪大肠菌群;

3.营养琼脂培养基:含牛肉膏、蛋白胨、氯化钠和琼脂。用于分离纯化后的菌体培养。

一、实验整体安排

实验准备;

采样、恒温培养富集及初筛;

观察产气情况及稀释、倒培养基、划线、涂布、倒置培养;

鉴定、接种;

菌种保藏。

二、实验准备具体操作步骤

①配置培养基(伊红美兰琼脂培养基:7.4g+200mL无菌水、调pH7.2~7.4,营养琼脂培养基:6.6g+200mL无菌水、调pH7.4±0.2,0.85%生理盐水、乳糖胆盐液体培养基2.6g+100mL无菌水,调pH7.4±0.2),,装瓶,高压蒸汽灭菌。

②包扎好培养皿,移液管,试管,进行干热灭菌。

③将配好的乳糖胆盐液体培养基分装入三个试管中,每个大约十毫升,包扎,灭菌。

④液体石蜡和涂布棒等其他实验玻璃器进行灭菌。

三、采样、培养

取水,湖水,废水三样约2~3滴于3支已灭菌的乳糖胆盐液体培养基试管中,贴好标签(采样时间、人物、温度,采样地点及天气情况),塞好棉塞,于恒温箱(37℃)培养18~24小时;

观察产气情况、稀释

①观察产气管有无气柱,标记阳性管数。

②样品稀释:

对已灭菌的5只试管编号(分别为1、2、3、4、5号),从样液试管取1mL样品液放入盛有9mL生理盐水的试管中为1号试管,换一只移液管,按上述方法依次配置5份10倍系列稀释液。贴明标签。

采用划线、涂布法,具体如下:

①涂布平板法:

将已熔化的营养琼脂培养基倒入无菌平皿,制成无菌平板,冷却凝固后,将一定量的含大肠菌群的污水滴加在平板表面,再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面,置培养箱中37℃培养24小时。经培养后挑取单个菌落。

涂布平板法操作:

1.将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中;

2.取少量菌液(不超过0.1ml),滴加到培养基表面;

3.将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃,待酒精燃尽后,冷却8~10s;

4.用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿,使涂布均匀。

注意:

1.将涂布器末端浸在盛有体积分数为70%的酒精的烧杯中。取出时,要让多余的酒精在烧杯中滴尽,然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。

2.操作中一定要注意防火,不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中,以免引燃其中的酒精。)

②平板划线法:

经培养后挑取单个菌落,接种环以无菌操作沾取少许菌落,在无菌伊红美兰琼脂培养基平板表面进行连续划线,微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少,并逐步分散开来,如果划线适宜的话,微生物能一一分散。在37℃经培养24小时后,可在平板表面得到单菌落。(有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的,故必须反复分离多次才可得到纯种。)

平板划线操作:

四、鉴定

观察EMB平板,菌落呈紫黑色,具有或略有金属光泽,或者呈淡紫红色,仅中心颜色较深,选取符合上述特征的单个菌落进行革兰氏染色,镜检(油镜)观察是否为无芽孢的革兰氏阴性短杆菌。

五、菌种保藏

1、斜面低温保藏法

此法为最常用的一种。一般霉菌;放线菌和有芽孢的细菌可保存2~4个月,酵母菌可保存2个月,无芽孢的细菌最好每周移接一次。操作过程如下:

a.接种:将要保藏的菌种接入斜面培养基上,试管上贴好标签,写上菌种名称,时间。

b.培养:各类菌按其所需温度和时间进行培养。

c.保藏:选取生长健壮的菌种,于其试管带棉塞的上半部用灭菌的塑料包扎好,以防棉塞受潮感染杂菌。置于4℃冰箱中保藏。

2、液体石腊保藏法

此法可用不分解石腊的菌种保藏。保存时间是半年至一年。放线菌;霉菌和产芽孢菌可保藏二年。液体石腊可防止培养基水分的蒸发,而引起的菌种死亡。同时可阻止氧气进入,防止好氧菌的生长。从而延长菌种保藏的时间。但需注意的是试管必须直立放置,并且不便携带。操作过程如下:

a.液体石腊的灭菌:将液体石腊装入锥形瓶中,量不超出锥形瓶体积的1/3,塞上棉塞,包扎好后,进行高压蒸汽灭菌二次(120℃30分钟)。再在110~120℃干燥箱中蒸发掉蒸汽灭菌时带入的水分。此时石腊透明清亮状。经检验确定无菌后备用。

b.菌种培养:将所需的菌种经培养后,选取健状的保藏。

c.加石腊油:用无菌管吸取石腊油加入菌种试管中,以高出菌种斜面顶点1cm为宜。少了会因培养基露出油面,而使培养基变干造成菌死亡。

d.收藏:试管上部用塑料包扎好,垂直立于冰箱中4℃。

e.恢复使用:当要使用菌种时。倾出石腊油。此石腊油可再灭菌重复使用。接种培养。由于菌体外粘有油。第一次的菌生长缓慢,性状恢复不是很好。所以要再移植一次才能得到良好的菌种。

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