高效液相色谱仪测定山楂中熊果酸含量的应用方案

一、熊果酸介绍

熊果酸为山楂中的主要活性成分，具有抗高血脂、降血糖、镇静、抗炎、抗菌等多种药理作用，熊果酸还具有明显的抗氧化功能。2015年版药典山楂项下未对其熊果酸建立含量测定。

二、方案简介

目的：建立山楂中熊果酸含量测定HPLC方法。

方法：采用高效液相色谱法检测熊果酸含量，以甲醇-水（20：80）为流动相，检测波长为210nm，流速为10ul。

结果：标准曲线的绘制及线性范围得熊果酸线性回归方程为y=22.3880x+1.2043，相关系数r为0.9998，表明熊果酸在1～60μg/ml范围内呈现良好线性关系。精密度RSD为1.09%，重复性RSD为1.83%，表明该方法重现性良好。72小时内稳定性试验熊果酸峰面积RSD为1.10%，表明该样品溶液的稳定性良好。

结论：熊果酸可作为山楂质量控制指标之一，本方法简便、准确、灵敏度高、重现性好，可作为山楂中熊果酸的含量测定方法，可有效控制山楂的内在质量。

三、方案详解

1、仪器及试药 

1.1仪器

高效液相色谱仪（四元梯度系统），紫外检测器，色谱柱为ZorbaxSB-C18（4.6×250mm，5μm），紫外可见分光光度计，数控超声波清洗器，电子调温电热套，恒温摇床。

1.2试药

熊果酸对照品：(中国食品药品检定研究院，批号:110742-201212，供含量测定用)；山楂药材（经检验为药典品种的市售样品）

2、方法与结果 

2.1山楂中熊果酸测定

本文采用高效液相色谱法测定山楂中熊果酸的含量，为山楂药材质量控制提供科学依据。

2.1.1检测波长测定

取熊果酸对照品，加甲醇溶解并制备成一定浓度的溶液，以甲醇为空白溶剂，经紫外可见分光光度计测定其最大吸收波长，结合现有文献资料报道，最后确定检测波长为210nm。

2.1.2流动相优化

在文献资料中，有用乙腈-水-磷酸、甲醇-磷酸盐缓冲液、乙腈-甲醇-0.5%醋酸铵等系统作为流动相，但经实验考察后发现，这些系统存在或可能分析时间过长，或样品分离效果欠佳等因素。经实验摸索后发现，以甲醇-水系统可以很好的避免影响因素。

2.1.3色谱条件

以甲醇-水（80：20）为流动相，检测波长为210nm，柱温40℃，进样量为10μl。经测定，分离度均大于2.0%，理论塔板数均在6000以上。

2.1.4熊果酸对照品储备溶液的制备

精密称取熊果酸对照品0.01272g，置10ml容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，摇匀，即得对照品储备液（浓度约1.0mg/ml）。

2.1.5供试品溶液的制备

取本品粉末（过2号筛）0.5g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，浸泡1h，超声30min，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.6标准曲线的绘制及线性范围

精密量取上述对照品储备液，置量瓶中，分别制备1、2、5、10、20、60μg/ml的标准溶液，用2.1.3项下的色谱条件绘制标准曲线，得熊果酸线性回归方程为y=22.3880x+1.2043，相关系数r为0.9998，表明熊果酸在1～60μg/ml的浓度范围内呈现良好的线性关系。

2.1.7供试品溶液制备方法的优化

2.1.7.1取本品粉末（过2号筛，下同）0.5g，精密称定，置锥形瓶中，精密称定，精密加入甲醇50ml，称定重量，浸泡1h，水浴锅加热回流30min，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.7.2

取本品粉末0.5g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，浸泡24h，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.7.3

取本品粉末0.5g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，浸泡1h，超声30min，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

经测定，方法3的提取效率明显优于方法1、2，在结合实际工作中的可操作性和提取率，最后确定方法3作为最终的提取方法。

2.2精密度试验

取10μg/ml熊果酸对照品溶液，按上述色谱条件进样，重复进样6次，测得RSD为1.09%，表明仪器性能良好。

2.3重复性试验

取同一批山楂样品5份，按上述样品制备项下方法，依法操作制备样品溶液。平行测定5次，结果熊果酸的平均含量为0.57%，RSD为1.83%。表明该方法重现性良好。

2.4稳定性试验

取同一批山楂制备的样品溶液，在常温下放置，分别于0、6、24、48、72h分别测定1次，结果RSD为1.10%，表明该样品溶液的稳定性良好。

2.5回收率试验

精密称取已知熊果酸的山楂样品约0.5g，共5份，分别精密加入对照品溶液(熊果酸浓度为0.05088mg·ml-1)10ml，按上述样品制备方法制备加样回收供试品溶液并注入高效液相色谱仪，计算平均回收率。

3、讨论

山楂作为常用的中药材（饮片）之一，在2015年版药典收录的方法中，未采用HPLC或者更先进的方法测定其活性成分的含量。本实验方法刚好弥补了这个空缺，更好的体现中药现代化要与时俱进的要求，更符合中国中药标准现代化的要求。

本方法操作简便，较更好的鉴别山楂内在质量的优劣，可以替代熊果酸薄层鉴别，更具有科学性。

（内容来源仪器信息网）

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