微生物学实验室的主要仪器设备有哪些？

（一）净化工作台(Clean Bench)

净化工作台是一种局部层流装置，能在局部形成高洁度的工作环境。它由工作台、过滤器、风机、静压箱和支撑体等组成，采用过滤空气使工作台操作区达到净化除菌的目的。室内空气经预过滤器和高效过滤除尘后以垂直或水平层流状态通过工作台的操作区，由于空气没有涡流，所以，任何一点灰尘或附着在灰尘上的杂菌都能被排除，不易向别处扩散和转移。因此，可使操作区保持无菌状态。

与无菌室和接种箱比较，使用净化工作台具有工作条件好、操作方便、无菌效果可靠、无消毒药剂对人体危害、占用面积小且可移动等优点。如果放在无菌室内使用，无菌效果更好。其缺点是价格昂贵，预过滤器和高效过滤器还需要定期清洗和更换。

（二）高压蒸汽灭菌锅（High-Pressure Steam Sterilization Pot）

高压蒸汽灭菌锅是一个密闭的、可以耐受一定压力的双层金属锅。锅底或夹层内盛水，当水在锅内沸腾时由于蒸汽不能逸出，使锅内压力逐渐升高，水的沸点和温度可随之升高，从而达到高温灭菌的目的。一般在0.11MPa的压力下，121℃灭菌20~30min，包括芽孢在内的所有微生物均可被杀死。如果灭菌物品体积较大，蒸汽穿透困难，可以适当提高蒸汽压力或延长灭菌时间。

高压灭菌锅有卧式、立式、手提式等多种类型，在微生物学实验室，最为常用的是手提式和立式高压蒸汽灭菌锅。和常压灭菌锅相比，高压灭菌锅的优点是灭菌所需的时间短、节约燃料、灭菌彻底等。其缺点是价格昂贵，灭菌容量较小。

（三）培养箱（CultureBox）

培养箱是培养微生物的专用设备。制热式培养箱是由电炉丝和温度控制仪合成的固定体积的恒温培养装置，大小规格不一。微生物实验室常用的培养箱工作容积有450×450×350mm³或650×500×500mm³，适用于室温至60℃之间的各类微生物培养。目前，随着科学水平的发展，培养箱设备的完善程度和价格有很大差别。有各种结构合理、功能齐全的培养箱，如恒温培养箱、恒温恒湿培养箱、低温培养箱、微生物多用培养箱和二氧化碳培养箱等。有的用计算机控制，可选择多条时间线变换温差，从而克服了环境温度的影响，一年四季均能达到培养要求的温度。

微生物多用培养箱是集加热、制冷和振荡于一体的微生物液体发酵装置。工作室的温度在15~50℃范围内任意选定，选定后经温控仪自动控制，保持工作室内恒温。同时设有可控硅调速系统，振荡机转速可在1~220rpm范围内任意调控。

（四）干燥箱（DryingBox）

干燥箱是用于除去潮湿物料内及器皿内外水分或其它挥发性溶液的设备。类型很多，有箱式、滚筒式、套间式、回转式等。微生物学实验室多用箱式干燥箱，大小规格不一。工作室内配有可活动的铁丝网板，便于放置被干燥的物品。制热升温式干燥箱也是有电炉丝和温度控制仪组成，可调节温度从室温至300℃任意选择。有的干燥箱采用导电温度计为敏感元件，配合晶体管和继电器组成自动控制系统，克服了金属管型热膨胀控制的缺点。

此外，还有真空干燥箱(配有真空泵和气压表)，可在常压或减压下操作。

（五）摇床（ShakingBed）

摇床又称摇瓶机，它是培养好气性微生物的小型试验设备或作为种子扩大培养之用，常用的摇床有往复式和旋转式两种。往复式摇床的往复频率一般在80~140次/min，冲程一般为5~14cm，如频率过快、冲程过大或瓶内液体装量过多，在摇动时液体会溅到包扎瓶口的纱布或棉塞上，导致杂菌污染，特别是启动时更容易发生这种情况。

旋转式摇床的偏心距一般在3~6cm之间，旋转次数为60~300rpm。

放在摇床上的培养瓶（一般为三角瓶）中的发酵液所需要的氧是由空气经瓶口包扎的纱布(一般8层)或棉塞通入的，所以氧的传递与瓶口的大小、瓶口的几何形状、棉塞或纱布的厚度和密度有关。在通常情况下，摇瓶的氧吸收系数取决于摇床的特性和三角瓶的装样量。

往复式摇床是利用曲柄原理带动摇床作往复运动，机身为铁制或木制的长方框子，有一层至三层托盘，托盘上有圆孔备放培养瓶，孔中凸出一个三角形橡皮，用以固定培养瓶并减少瓶的振动，传动机构一般采用二级皮带轮减速，调换调速皮带轮可改变往复频率。偏心轮上开有不同的偏心孔，以便调节偏心距。往复式摇床的频率和偏心距的大小对氧的吸收有明显的影响。

旋转式摇床是利用旋转的偏心轴使托盘摆动，托盘有一层或两层，可用不锈钢板、铝板或木制板制造。在三个偏心轴上装有螺栓可调节上下，使托盘保持水平。这种摇床结构复杂，造价高。其优点是氧的传递较好、功率消耗小、培养基不会溅到瓶口的纱布上。

（六）显微镜（Microscope）

微生物个体微小，必须借助显微镜才能观察清楚它们的个体形态和细胞结构。因此，在微生物学的各项研究中，显微镜就成为不可缺少的工具。

显微镜的种类很多，根据其结构，可以分为光学显微镜和非光学显微镜两大类。光学显微镜又可分为单式显微镜和复式显微镜。最简单的单式显微镜即放大镜（放大倍数常在10倍左右），构造复杂的单式显微镜为解剖显微镜（放大倍数在200左右）。在微生物学的研究中，主要是复式显微镜。其中以普通光学显微镜（明视野显微镜）最为常用。此外，还有暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜、偏光显微镜、紫外光显微镜和倒置显微镜等。非光学显微镜为电子显微镜。

下面以普通光学显微镜为例，简单介绍一下显微镜的结构、原理等。

1. 基本构造

    普通光学显微镜由机械装置和光学系统两部分组成（如图1.1）。机械装置由镜座、镜臂、载物台、镜筒、物镜转换器和调焦装置（粗调焦螺旋和微调焦螺旋）等组成。光学系统包括物镜、目镜、聚光器、彩虹光阑和光源等。

2. 成像原理和性能

普通光学显微镜的成像原理如图1.2所示。将被检物体置于集光器和物镜之间，平行的光线自反光镜折入聚光器，光线经过聚光器穿过透明的物体进入物镜后，即在目镜的焦点平面（光阑部位或附近）上形成一个初生倒置的实像。从初生实像射过来的光线，经目镜的接目透镜而达到眼球。这时的光线已变为或接近平行光，再透过眼球的水晶体时，便在视网膜后形成一个直立的实像。

显微镜的主要性能包括放大率、工作距离、焦点距离、焦点深度、分辨率、镜像亮度和视场亮度等。

（1）放大率

在显微镜组合中，光线通过物镜先将物体放大为一个左右相反、前后倒置的实像，经目镜再次放大为一个虚像，这一虚像的大小和物体大小的比例，就叫放大率。

显微镜的放大率 = 物镜的放大倍数×目镜的放大倍数

               = （光学筒长/ 物镜焦距）×（明视距离/ 目镜焦距）

明视距离是已知数，物镜焦距和目镜焦距在说明书上有数据可查，而光学筒长是指物镜上焦平面到目镜下焦平面的距离，一般为160mm。

（2）工作距离

当显微镜调准焦距时，从盖玻片到物镜前透镜表面之间的距离叫工作距离。工作距离的大小和物镜的放大倍数与数值口径有关。物镜放大倍数和数值口径愈大，则工作距离愈小，反之愈大。表1.1表示标准物镜的主要性质。一般油镜的工作距离最短，约0.2mm。因此，要求盖玻片的厚度为0.17~0.18mm。若盖玻片过厚，就不可能将被检体聚焦，且易引起物镜的意外损坏。

表1.1标准物镜的主要性质

（3）焦点距离（焦距）

它是指平行光线经过单一透镜后集于一点，由这一点到透镜中心的距离。一个物镜通常有几个不同性质的透镜组成。因此，它的焦距的测定比较复杂。一般，显微镜的物镜上都注明焦距的长度。物镜的放大倍数越大，焦距越短。

（4）焦点深度

在使用显微镜时，当焦点对准某一物体时，不仅位于该点平面上的各点都可看清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也可看清楚，这个清晰部分的厚度就是焦点深度。焦深与总放大率和数值口径成反比，因此，高放大率和高数值口径的显微镜其焦深就浅，不能看到标本的全厚度。必须调节螺旋仔细地从上到下进行观察。另外，被检物体周围介质（封片剂）的折射率加大可增大焦深。尤其在显微照相时，更应考虑封片剂的使用。

（5）数值口径（numerical aperture 简写为NA）

数值口径是指物镜与标本间介质折射率（n）和光线投射到物镜上的最大入射角（α）一半正弦的乘积。其计算公式为：

NA=n×sin(α/2)

其中，n=介质折射率，干燥系物镜n=1，油浸系物镜n=1.515；α=光线进入物镜的最大夹角，也称镜口角。

（6）分辨率

显微镜能够分辨物体结构中两点之间的最小距离的能力，就叫分辨率。分辨率与物镜的数值口径成正比，与光波波长成反比。因此物镜的数值口径愈大，光波波长愈短，则显微镜的分辨率愈大，被检物体的细微结构也愈明晰地区分出来。因此，一个高分辨率意味着一个小的分辨距离。显微镜的分辨率是用可分辨的最小距离（D）来表示的：

D=λ /（2NA）

（7）镜像亮度与视野亮度

镜像亮度是显微镜的图像亮度的简称，指在显微镜下观察到的图像的明暗程度。使用时，对镜像亮度的要求，一般是使眼睛既不感到暗淡，又不耀眼。镜像亮度与数值口径平方成正比，，与总放大倍数的平方成反比。

视场亮度是指显微镜下整个视场的明暗程度。视场亮度不仅与目镜、物镜有关，还直接受聚光镜、光阑和光源等因素的影响。在不更换物镜和目镜的情况下，视场亮度大，镜像亮度也大。

3. 油镜的基本原理

油镜，也称油浸物镜，一般在镜头上标有“HI”和“HO”字样，或在镜头下缘刻有1~2道黑线作为标记。使用油镜时，需将镜头浸在香柏油中进行观察，这是为了消除光由一种介质进入另一种介质时发生散射，结果不仅提高了放大倍数，还增加了照明度和分辨率。

（1）照明亮度

油镜与其它物镜不同之处在于玻片和物镜之间的介质不是空气，而是一种和玻璃折射率（n=1.52）相近的香柏油（n=1.515）。如果玻片与物镜之间的介质是空气（n=1.00），光线通过玻片后发生散射，进入视场的光线显然减少，结果降低了视场亮度。当光线通过玻片又通过香柏油进入物镜就不发生散射，结果，提高了照明度，观察的标本显得更清晰（图1.3）

（2）分辨率强

使用油镜还能增加显微镜的分辨率。由于显微镜分辨率与物镜的数值口径（NA）成反比，与波长成正比。因此物镜的数值口径愈大，光波愈短，则显微镜的分辨率就愈大。人们肉眼所能感受的光波平均长度为0.55μm，加入数值口径NA=0.65高倍物镜，能分辨两点之间的距离为0.42μm，而小于0.42μm的两点之间距离就分辨不出，而使用数值口径NA=1.25油镜，能分辨两点之间的最小距离为0.22μm。因为不论总放大倍数多大，用普通光学显微镜是无法观察到小于0.2μm的物体，但大部分细菌直径在0.5μm以上，故用油镜就能清晰地观察到细菌的个体形态。

4. 注意事项

使用显微镜应注意以下事项： 

（1）取拿显微镜时，必须用一手握住镜臂，另一手托住显微镜的镜座，使显微镜保持直立的状态，切忌用单手提拿。 

（2）将显微镜放置桌上时，务必要轻轻放下。 

（3）显微镜的镜头必须保持清洁，必要时用擦镜纸擦拭镜头，不可使用布或一般的纸，以免损伤镜头。 

（4）将显微镜轻轻地放置桌上，镜座后缘位于离桌子边缘约5cm处。 

（七）接种箱（Clean Box）

接种箱分为固体菌种接种箱和液体菌种接种箱两种。固体菌种接种箱是一个用木料和玻璃制成或由有机玻璃焊接而成的密闭小箱。又分为双人和单人操作箱。箱体可大可小，一般箱体长约143cm，宽86cm，总高154cm，支架76cm。箱的上部左右两侧各装有两扇能启闭的玻璃推拉门，方便菌种进出。窗的下部分别设有两个直径约13cm的圆洞，两洞的中心距离为52cm（同肩宽），洞口装有带松紧带的袖套，以防双手在箱内操作时，外界空气进入箱内造成污染。操作时两人相对而坐，双手通过袖套伸入箱内。箱两侧最好也装上玻璃，箱顶部为木板或玻璃。箱内顶部装有紫外线杀菌灯和照明用日光灯各一支。箱体安装木板或玻璃均可，但要注意密封。

液体菌种接种箱是专为移接液体菌种而设计的。比固体菌种箱窄长，单侧两人操作。内设轨道和紫外线灯，箱两端开有高25cm，宽10cm的长方形出口，方便菌种进出，洞口设有小推门。进出口下处设蒸汽源，接种时用蒸汽封住进出口，以防杂菌进入箱内。箱背面设有液体菌种移接管能进入的小孔。

接种箱灭菌时，用紫外线照射30min。如果没有紫外线灯，可用甲醛和高锰酸钾（甲醛10～14mL/m³+高锰酸钾5～7g/m³空间）熏蒸30min以上。使用时，先将所需物品和工具放入接种箱内，然后进行药剂熏蒸和紫外线灭菌，再按无菌操作进行接种。

接种箱的结构简单，造价低廉，易消毒灭菌，操作方便，而且人在箱外操作，气温较高时也能作业。缺点是进出培养基费工费时，每次接种前都需要进行灭菌。

（八）冰箱

微生物实验室的冰箱主要有两种：普通冰箱和低温冷冻冰箱。普通冰箱一般都具有两个柜子，即鲜藏柜和冷藏柜，温度分别为4℃和－20℃；低温冷冻冰箱温度一般控制在－40～－80℃。它们都可以用于微生物菌种保藏。鲜藏柜常用于保存斜面菌种，保藏时间在3个月左右。超过3个月，斜面就会变干，因此需要转接菌种。如果要长时间保存菌种，则需要经过处理后，贮藏于普通冰箱的冷藏柜或低温冷冻冰箱中，它们的保藏时间较长，一般都在1年以上。