分光光度法绘制标准曲线常见问题解决方法

一、标准曲线

 分析检测中绘制标准曲线的目的是可以根据标准曲线查出待测物质的含量，所以标曲的制定是实验室工作中必不可少的工作。

 很多用户对于标准曲线有很多疑问，例如做标准曲线真的那么简单？你的标曲真的做好了吗?导致标准曲线弯曲的原因是什么？RSD值、线性相关系数和线性方程如何？线性好与不好分别由于哪些原因造成的？是仪器、标液，还是配制的问题？

 首先说明下前期测定时注意事项：

1、仪器校验好。

2、移取液体体积要精确，保证迅速准确，尽可能用一根移液管；为减小人为误差，同一种液体要一个人操作。

3、保证标准品的纯度，所用标准品最好是新打开的，纯度较高的固体或溶液，防止污染。

4、容器要保证洁净。

5、根据标准品理化性质注意加样的先后顺序。

6、如果要测OD值，应保证测前各管液体充分混匀。

7、若还是有某个点误差较大，应舍弃。

    其次，还要了解如下知识：

1.样品的浓度等指标是根据标准曲线计算出来的，所以首先要把做标准曲线看作是比做正式实验还要重要的一件事，否则后面的实验结果无从谈起。

2、设置标准曲线样品的标准浓度范围要有一个比较大的跨度，并且要能涵盖你所要检测实验样品的浓度，即样品的浓度要在标准曲线浓度范围之内，包括上限和下限。而对于呈s型的标准曲线，尽量要使实验样品的浓度在中间坡度最陡段，即曲线几乎成直线的范围内。

3、最好采用倍比稀释法配制标准曲线中的标准样品浓度，这样就能够保证标准样品的浓度不会出现较大的偏离。

4、检测标准样品时，应按浓度递增顺序进行，以减少高浓度对低浓度的影响，提高准确性。

5、标准曲线的样品数一般为7个点，但至少要保证有5个点。

6、做出的标准曲线相关系数因实验要求不同而有所变动，但一般来说，相关系数r至少要大于0.98，对于有些实验，至少要0.99甚至是0.999.

二、分光光度​法绘制标准曲线所遇问题

1、单色光纯度不够

问题：标准曲线上端向下弯曲。

措施：光度法中要求在最大吸收峰处测定吸光度，光度计的有效谱带宽度越窄越好，有利于获得纯度高的单色光。

2.比色皿的厚度或光学性能不一致

如果装试剂空白液的比色皿较其它比色皿薄或对光的吸收和反射少一些，则曲线的延线与纵坐标相交；反之，与横坐标相交。

3.显色反应和反应条件的问题

当显色反应的灵敏度不高时，被测物低于某一浓度就不能显色，当浓度不同时，溶液对光的吸收、散射的程度不同，低浓度段往往弯曲，加上浓度高时部分胶体颗粒的聚沉，致使测定的吸光度降低，曲线上端向下弯曲。

4.操作上的原因

问题：褪色反应，显色溶液的颜色不稳定、易褪色，若比色时间超过了稳定时间，标准系列中高浓度溶液颜色减褪，致使曲线上端向下弯曲。

措施：控制好显色剂的加入时间，可以每加3份，停3～3min，再加上3份，依次进行，以使每支比色管的显色时间相近。

5、干扰物质的影响

三、标准曲线的检验

标准曲线的检验是实际操作中最大的难点，也是工作中误区和争议最多的话题，下面了解下最重要的三大检验项目：

1.精密度检验

标准曲线的精密度检验：精密度检验就是看试验点距离拟合的直线的距离有无异常，所以也称线性检验（拟合检验），需用F检验，P<0.05作为线性检验合格的标准。

2.截距检验

3.斜率检验

标准曲线的截距检验和斜率检验分别考察Y=a+bX中a和b与0的统计学差异，a与0有差别说明有试剂空白或系统误差，而b若与0没差别说明仪器的灵敏度根本达不到分析要求。

标准曲线的检验应该是线性检验结合失拟检验，以及残差的正态性检验结合才是统计学上比较完备的。

（内容参考实验与分析网）